|
|
Bioinformatic analysis of RNA dynamics during mammalian oocyte-to-embryo transition
Horvat, Filip ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Bruce, Alexander (oponent) ; Vioristo, Sanna (oponent)
Přeměna oocytu na emryo (oocyte-to-embryo transition, OET) je složitý biologický proces, při kterém terminálně diferencovaný oocyt podstupuje řadu koordinovaných změn, aby dal vznik souboru totipotentních buněk - blastoméře předimplantačního embrya. U savců je tento proces kontrolován převážně mechanismy posttranskripční regulace. Technologické pokroky v metodách sekvenování nové generace během poslední dekády umožnily studovat OET pomocí bioinformatických analýz transkriptomických a genomických datových sad. Práce předložená v této disertaci zkoumá mechanismy posttranskripční regulace a dynamiku různých RNA během OET pomocí podrobných výpočetních analýz. Práce je rozdělena do tří témat, která pokrývají různé aspekty regulace OET u savců a ilustrují role různých druhů RNA. První téma, které je v této práci popsáno, se zabývá složením a dynamikou maternálního transkriptomu u myší. Ve svém výzkumu jsme zkoumali roli deadenylázy CNOT6L při odbourávání maternálních mRNA u myší. Poskytli jsme důkazy, že subfertilita zvířat s defektem Cnot6l pravděpodobně souvisí s narušením deadenylace a degradace maternálních mRNA uložených v oocytu. V další studii jsme pomocí výpočetní analýzy zkoumali evoluční historii a funkci Sirena1, nejhojněji zastoupené lncRNA v myším oocytu. Analýza diferenciální exprese myších...
|
|
|
Endogenně produkovaný sulfan v reprodukčním traktu samice ve vztahu k fertilizaci
BRICHCÍN, Jiří
Odhalení mechanismů zodpovědných za správný průběh oplození a časného embryonálního vývoje pomáhá v rozvoji asistované reprodukce člověka a technologií v chovech hospodářských zvířat. Jedním z regulačních mechanismů zapojených do reprodukce je gasotransmiter sulfan, jehož buněčná signalizace v pohlavních buňkách je dosud plně nepopsána. Dle stanovené hypotézy je sulfan uvolňován v samičím traktu, kde fyziologicky ovlivňuje spermie a je tak nezbytný pro oplození a vývoj prvojader. Cílem bylo ověřit expresi sulfan-uvolňujících enzymů a existenci časo-prostorového gradientu sulfanu v rámci estrálního cyklu myši (časová osa) a porovnání expresního profilu ampuly vejcovodu a uterotubálního spoje (prostorová osa). Experimenty probíhaly na modelu laboratorní myši (Mus musculus). Exprese sulfan-uvolňujících enzymů byla studována pomocí western blotu. Produkce sulfanu byla stanovena kolorimetrickou metodou. Úloha sulfanu v procesu oplození byla studována pomocí in vitro fertilizace spermiemi ošetřenými donorem sulfanu a imunocytochemického barvení takto vzniklých zygot. V rámci vaječníku a vejcovodu byla zjištěna exprese všech známých sulfan-uvolňujících enzymů, tj. cystationin--lyázy (CTH), cystationin-ß-syntázy (CBS) a 3-merkaptopyruvát sulfurtransferázy (3-MPST). Ani jeden z enzymů nevykazoval statisticky významné odlišnosti v expresi ve fázi estru a diestru. Analogické výsledky byly zjištěny i v rámci prostorové osy; ampula vejcovodu i uterotubální spoj exprimovaly enzymy CTH, CBS i 3-MPST, statistické odlišnosti však zaznamenány nebyly. To platí i v případě produkce sulfanu těmito tkáněmi. Vliv sulfanu na proces oplození byl analyzován podle laminu B1, markeru vývoje paternálního prvojádra. Provedená analýza nepotvrdila vliv donoru sulfanu na vývoj prvojader zygot. Práce prokázala, že sulfan je enzymaticky uvolňován tkáněmi reprodukčního traktu samice, bez ohledu na fázi estrálního cyklu či lokalizaci ve vejcovodu. Sulfan, který pochází z reprodukčního traktu samice, zde patrně fyziologicky ovlivňuje spermie, které jsou oplození schopné a vedou k vývoji prvojader.
|
|
|
Long Non-Coding RNAs in Oocyte-to-Embryo Transition
Ganesh, Sravya ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Shkumatava, Alena (oponent)
Přechod z oocytů na embryo (OET) je jednou z nejkomplexnějších vývojových událostí, během níž se diferencovaný oocyt promění v totipotentní blastomery embrya. Během OET transkripčně neaktivní oocyt prochází masivním přeprogramováním genové exprese, které ho transformuje do transkripčně aktivní zygoty. Přestože četné studie přispěly k pochopení mechanismu OET, mnoho genů zapojených do OET je neznámých. Úplně nová úroveň možné regulace OET přišla s objevem dlouhých nekódujících RNA (lncRNA). LncRNAs jsou transkripty pol II delší než 200 nukleotidů, které jsou typicky sestřižené a polyadenylované, ale nekódují proteiny. Zatímco lncRNA byly studovány v mnoha modelových systémech včetně embryonálních kmenových buněk, jejich exprese v oocytech a časných embryích a příspěvek k OET byly na začátku tohoto projektu neznámé. Ve svém doktorském projektu jsem se zaměřila na identifikaci, anotaci a analýzu lncRNA objevujících se během OET. Pomocí analýzy RNA-Seq bylo identifikováno 1600 lncRNA, které byly anotovány v myších oocytech a časných embryích. Většina lncRNA byla nová s expresí výlučně během OET. Významná část těchto lncRNA souvisela s LTR retrotransposony, což zřejmě souvisí s k jejich nedávným vznikem a evolucí. Expresní analýza OET lncRNA odhalila kromě výrazně odlišných maternálních a zygotických...
|
|
|
Analysis of pluripotent gene expression program in early embryos and embryonic stem cells
Moravec, Martin ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Motlík, Jan (oponent)
Pluripotence je schopnost buňky diferencovat do jakéhokoliv buněčného typu. Formuje se během časného embryonálního vývoje u savců a její vznik je spojen s reprogramací genové exprese na globální úrovni. Proces přirozeného vzniku pluripotence není stále zcela pochopen. Pro získání nového pohledu na události, které vedou ke vzniku pluripotence u savců, studovali jsme změny v genové expresi během oocyt-zygotického přechodu u myši. V tomto modelovém systému, oplodněné vajíčko podstoupí reprogramaci, která vede k vytvoření pluripotentních blastomer. Tyto blastomery zakládají samotné embryo. Cílem mé diplomové práce bylo analyzovat aktivaci transkripce během časného vývoje a vyvinout metodu pro monitorování exprese genů v oocytech, časných embryích a embryonálních kmenových buňkách. Metoda využívá kvantitativní PCR a umožnuje změřit expresi až 48 vybraných genů, které slouží jako markery pro maternální degradaci, aktivaci pluripotentního programu a diferenciaci do zárodečných linií. Dále ukazujeme, že náš systém monitoruje dynamiku transkriptomu během oocyt-zygotického přechodu, a získané výsledky jsou srovnatelné s daty naměřenými pomocí jiných metod. Díky našemu bioinformatickému přístupu jsme navíc identifikovali nové oocyt-specifické a zygotické nekódující RNA. Klíčová slova: pluripotence,...
|
host ::
RSS.